Постановление Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь, Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 13.03.2001 N 9/15 "Об утверждении нормативных правовых актов по борьбе с губкообразной энцефалопатией крупного рогатого скота"

(текст документа по состоянию на январь 2010 года. Архив) обновление

Документы на NewsBY.org

Содержание

Стр. 2

20.2. Для фиксации головного мозга его целиком помещают в фиксирующий раствор в соответствии с пунктом 19 настоящей Инструкции.

20.3. Зафиксированный мозг помещают в ударопрочную емкость, при этом объем фиксирующего раствора должен быть в 10 раз больше объема мозга. В таком виде материал должен храниться не менее 2 недель, после чего его необходимо доставить в лабораторию вирусных и прионных инфекций крупного рогатого скота Республиканского унитарного предприятия "Белорусский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского".

Глава 7. ПАТОГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

21. Сущность метода заключается в микроскопическом определении степени выраженности и характера изменений в головном мозге животных, пораженных губкообразной энцефалопатией крупного рогатого скота.

22. Аппаратура, материалы и инструменты, используемые для гистологической обработки и окраски тканей, - согласно приложению 5.

23. Патологогистологическую обработку материала проводят в следующей последовательности.

23.1. Взятие материала. Взятие материала от животных производят из фиксированного мозга в соответствии с пунктами 18 и 19 настоящей Инструкции. Вырезают кусочки зафиксированных тканей мозга в виде пластинок не толще 0,5 - 1 см из различных участков органа.

23.2. Фиксация материала. Патологический материал обязательно должен быть этикетирован и зафиксирован немедленно и непосредственно после взятия (но не позднее 12 часов). Категорически запрещается патологический материал замораживать.

23.3. Уплотнение материала. Уплотнение материала проводят при помощи прозрачных сред (целлоидина, парафина).

Уплотнение материала проводят в основном путем заливки в прозрачные среды (парафин, целлоидин). Для заливки материала в парафин необходимы: спирты (50, 60, 70, 80, 90, 100 град.), 100-градусный хлороформ, хлороформ, хлороформ-парафин и парафин (2 - 3 порции).

Разведение спиртов проводят согласно приложению 6 к настоящей Инструкции.

Абсолютный (100 град.) спирт приготавливают путем добавления к 96 град. спирту безводного медного купороса (порошок серовато-белого цвета). Применяя для этой цели кристаллический медный купорос (CuSO4 x 5H2O), его необходимо предварительно обезводить путем медленного прокаливания (на электроплитке, газе). Этот процесс ведут в фарфоровой ступке при постоянном помешивании во избежание образования трудно разбиваемых комков фарфоровой и стеклянной палочкой - нельзя металлической или пластмассовой. Прокаливание длится 2 - 3 часа до получения порошка белого цвета, но не серого. Прокаленный купорос гигроскопичен, поэтому его хранят в банке или склянке с притертой пробкой. После охлаждения он пригоден к работе.

Процесс прокаливания медного купороса нужно вести в вытяжном шкафу, а при отсутствии последнего пользоваться ватно-марлевыми повязками.

В банку или склянку наливают необходимое количество спирта, затем добавляют обезвоженный медный купорос из расчета 10 - 15 процентов к объему спирта в течение 1 - 2 суток, периодически энергично встряхивают. Белый цвет порошка переходит в голубой вследствие поглощения купоросом воды. Этот процесс повторяют несколько раз до тех пор, пока после внесения спирта порошок не приобретет синее окрашивание, каждый раз сливая спирт в чистую посуду. Готовый абсолютный спирт переливают в чистую сухую емкость, после чего он годен к работе.

Парафин поступает, как правило, гомогенизированный. Для придания ему пластичности в расплавленный парафин рекомендуется добавлять пчелиный воск до 5 процентов, что облегчает получение качественных и тонких срезов.

Кусочки мозга толщиной 0,5 см выдерживают в каждом из реагентов по 3 - 4 часа, при использовании автомата для гистологической обработки тканей типа АТ-4 или АТ-5; затем - в хлороформ-парафине 2 - 3 часа при температуре 37 град. С; парафине I и II - по 45 - 60 минут при температуре 58 - 60 град. С. После этого заливают в формочки (чашки Петри) новую порцию парафина и помещают в него кусочки.

После появления достаточно плотной пленки застывшего парафина формочки с кусочками мозга погружают в емкость с холодной водой для равномерного охлаждения и уплотнения.

Не рекомендуется ставить формочки в холодильник, так как при очень быстром охлаждении нарушается структура парафина, который получается крошковатым и плотным. При соблюдении приведенных условий парафин после заливки представляет однородную массу. Наличие пузырей воздуха, молочно-белых зернистых участков свидетельствует о недостаточном удалении промежуточных сред или неравномерном охлаждении. Если проведено неудовлетворительное обезвоживание или заливка охлажденным парафином и кусочки материала будут вылущиваться из парафина, необходимо освободить кусочки от парафина и залить их вторично (начиная со спирт-хлороформа).

При отсутствии аппаратов АТ-4 или АТ-5 применяется сокращенная схема заливки - спирт 50 град., 75 град., 96 град., 100 град. и так далее с экспозицией в каждом по 6 - 12 часов, что приводит к удлинению срока обработки до 3 - 5 суток.

В последующем вырезают прямоугольные блоки, оставляя вокруг кусочка слой парафина шириной 1 - 1,5 мм. Для наклеивания блоки кладут на деревянный кубик и вдвигают между ними горячий шпатель. Дополнительно оплавляют по краям этим же шпателем. Блоки должны соответствовать колодкам и не выступать за их края. Деревянные кубики готовят из твердых пород дерева (березы, бука), можно из паркетных дощечек.

Достоинством метода заливки в парафин является относительная быстрота, возможность изготовления тонких (2 - 3 мкм) серийных срезов, а недостатком - некоторое уменьшение объема материала и необходимость воздействия на материал относительно высокой температуры.

Метод заливки патологического материала в целлоидин из-за его дефицита, длительности и трудоемкости в практических условиях используется редко.

23.4. Изготовление срезов (микротомирование):

При изготовлении срезов следует правильно использовать микротомные ножи, которые выпускают трех марок: "а" - из мягкой стали для целлоидиновых блоков (плосковогнутые), "б" - из более твердой стали для резки целлоидиновых и парафиновых блоков (имеет форму прямоугольного треугольника), "в" - из самой твердой стали для изготовления парафиновых и замороженных срезов (форма равнобедренного треугольника).

Марка стали обычно указывается на обутке ножа.

23.5. Парафиновые срезы готовят следующим образом:

23.5.1. парафиновый блок (на колодке) зажимают в объектодержатель микротома перпендикулярно ножу;

23.5.2. при помощи рукояток переместить рамки объектодержателя так, чтобы поверхность блока была горизонтальной ножу;

23.5.3. укрепить микротомный нож в поперечном положении, чтобы нож и края блока были параллельны;

23.5.4. установить микровинт на деление 20 - 30 микрон, подвести блок до легкого соприкосновения с ножом и закрепить, произвести грубую зачистку блока, чтобы обнаружилась ткань кусочка, краем ножа;

23.5.5. объектодержатель слегка сдвинуть, поставить нож ближе к середине;

23.5.6. подвести объектодержатель с блоком до легкого соприкосновения с ножом, закрепить его;

23.5.7. изготовить гистосрез.

Качество срезов зависит от величины и плотности объекта, твердости парафина, окружающей температуры и других факторов. Поэтому в одних случаях срезы получаются при быстром толчкообразном, в других, наоборот, при медленном и равномерном движении ножа. При изготовлении парафиновых срезов возможны дефекты согласно приложению 7 к настоящей Инструкции;

23.5.8. полученные срезы при помощи мягкой кисточки (слегка смоченной водой) или препаровальной иглы снимают с ножа и переносят на планшет или гладкую бумагу (лучше черную). Срезы подписывают с указанием объекта, с которого получены срезы, или напротив среза располагают соответствующий блок, с которого он сделан.

Перед расправлением срезов предварительно на обезжиренные предметные стекла наносят белковый клей, предназначенный для прикрепления их к стеклам;

23.5.9. для приготовления клея используют свежий яичный белок без примесей. 2 части белка взбивают тщательно вилкой до состояния пены, добавляют 1 часть глицерина, 1 кристаллик камфоры или тимола и размешивают. Смесь готова к использованию через 1 - 2 дня. На предметное стекло наносят маленькую каплю клея, растирают пальцем досуха и проносят над пламенем спиртовки 3 - 5 раз, пока не исчезнет помутнение на стекле.

Для расправления срезы переносят в емкость (чашку, бобовидный тазик) с теплой (46 - 48 град. С) дистиллированной водой, температуру контролируют термометром и расправляют. Более горячая вода приводит к расплавлению парафина. Лучше использовать спирт 70 град. С. Срезы кладут на воду или спирт той стороной, которая была обращена к ножу;

23.5.10. характер расправления серийных срезов несколько иной. Серию срезов вначале плавно подносят к краю емкости, затем несколько ускоренным движением вперед касаются воды нижним краем и при таком же движении вдоль краев чашки опускают на воду поочередно следующие срезы. Подготовленное ранее предметное стекло опускают концом в воду, подводят под срезы и подхватывают их препаровальной иглой за один из краев, затем плавно вынимают из воды стекло вместе со срезом. Остатки воды вокруг среза удаляют фильтровальной бумагой, ставят стекла вертикально в подставки и оставляют для сушки на несколько часов при комнатной температуре во избежание отклеивания их во время окраски. Допускается при небольшом количестве патологического материала изготовление замороженных срезов.

23.6. Окрашивание гистосрезов проводят в следующей последовательности:

23.6.1. окрашивание проводится с целью оптической дифференцировки структурных элементов тканей. Используемые в гистологической технике краски делятся на основные (ядерные, кислые (цитоплазматические, фоновые), нейтральные и специальные.

Из группы основных красок наибольшее применение имеют приготовленные из гематоксилина. Наиболее употребительными являются гематоксилин Эрлиха и гематоксилин Бемера;

23.6.2. гематоксилин Эрлиха состоит: из гематоксилина - 2 г, спирта 96 град. - 100 мл, воды дистиллированной - 100 мл, глицерина - 100 мл, квасцов алюмокалиевых - 3 г и кислоты уксусной ледяной - 10 мл. Приготовленный раствор гематоксилина Эрлиха наливают в широкогорлую банку, завязывают марлей 3 - 4 слоя и оставляют на свету для созревания на 3 - 4 недели, периодически взбалтывая. Созреваемая краска имеет темно-вишневый цвет, приятный запах, оставляет след на стекле. Такой раствор фильтруют и хранят в плотно закрытой посуде. Срезы окрашивают в течение 3 - 5 минут;

23.6.3. гематоксилин Бемера готовят следующим образом: 40 г алюмокалиевых квасцов растворяют в 400 мл дистиллированной воды при нагревании, охлаждают и фильтруют в широкий стакан, затем добавляют 20 мл 10-процентного спиртового раствора гематоксилина (на 96-градусном спирте), завязывают марлей и оставляют для созревания, как и гематоксилин Эрлиха.

При приготовлении гематоксилинов все компоненты добавляют в указанной последовательности после растворения предыдущего реактива. Перед каждым употреблением гематоксилин необходимо фильтровать во избежание выпадения осадков в срезах;

23.6.4. из кислых красок постоянное применение имеет эозин К (калий) или Н (натрий) в 0,25 - 0,5-процентных водных растворах. Концентрацию рабочего раствора определяют опытным путем. Для этого окрашивают несколько срезов в различных растворах краски (0,1; 0,2; 0,3% и так далее) в течение 2 - 5 минут, проверяют под микроскопом степень окрашивания и устанавливают оптимальную концентрацию.

Все краски для гистологических работ готовят только на дистиллированной воде.

23.7. Окраска срезов гематоксилин-эозином.

23.7.1. Этот метод позволяет определить не только наличие патологических изменений, но и ориентировать на необходимость применения других дополнительных методов для окончательного установления диагноза (например, по Ван-Гизону - на соединительную ткань, ретикулиновых волокон - по Футу, липидов - Суданом).

23.7.2. Окраску гистосрезов проводят в следующем порядке:

депарафинирование (ксилол - 3 порции, спирт 100 град., 96 град., 70 град., вода дистиллированная - 2 порции) по 2 минуты в каждом растворе;

промывка в водопроводной воде 60 - 90 секунд;

дифференцировка в солянокислом спирте (1-процентный раствор соляной кислоты в 70-градусном спирте) до появления розового цвета срезов (30 - 60 секунд);

промывка в водопроводной воде (лучше в двух порциях) 3 - 5 - 10 минут до посинения срезов;

окраска раствором эозина - 2 - 5 минут;

промывка в дистиллированной воде 40 - 60 секунд;

обезвоживание в спиртах возрастающей крепости (70 град., 96 град., 100 град.) по 1 минуте;

просветление гистосрезов в карбол-ксилоле 2 минуты;

окрашенные гистосрезы переносят в ксилол на 1 - 2 минуты, после чего заключают в бальзам.

Для просветления срезов используют карбол-ксилол в соотношении 1:4 - 1:10 (по объему). Для этого расплавляют в термостате (при 56 - 60 град.) кристаллическую карболовую кислоту (фенол) и смешивают с ксилолом, который также предварительно ставят в термостат.

23.8. Для заключения срезов под покровное стекло чаще применяется канадский или пихтовый бальзам;

23.8.1. затвердевшую смолу помещают в широкогорлую банку, заливают ксилолом (5:1) и ставят в термостат при 37 град. С. Бальзам должен иметь консистенцию жидкого мела. Кедровый бальзам - низкого качества, так как быстро кристаллизуется под покровным стеклом и гистопрепараты невозможно долго хранить;

23.8.2. при заключении срезов каплю бальзама наносят на предметное стекло под углом 45 град. и, когда бальзам растечется по краю, плавно его опускают на срез, поддерживая противоположный край иглой. Излишки бальзама удаляют со стекла салфеткой или тряпочкой, слегка смоченной ксилолом. Препарат кладут на планшет горизонтально на 24 - 48 часов, желательно под груз. Стекла этикетируют. Подписи делают тушью или чернилами по стеклу. При этом методе окраски ядра клеток лиловые или синие, цитоплазма - красного цвета различного тона, соединительная ткань - светло-розового цвета.

24. Характерные (патогномоничные) для губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота признаки согласно приложениям 8 - 10:

- диффузная вакуолизация и расплавление нейроглии (в виде множественных разной формы и величины сот);

- коагуляция цитоплазмы в нейронах, проявляющаяся в виде плотного сгустка с повышенной оксифильностью (красного цвета);

- наличие пикноза, рексиса и частичного лизиса ядер нейронов, иногда криброза цитоплазмы (множественные мелкие вакуоли);

- гипертрофия эндотелия кровеносных сосудов с явлениями кариопикноза и репсиса);

- наличие периваскулярных круглоклеточных астроцитных и макрофагальных элементов типа негнойного энцефалита (напоминающие "висна" у овец);

- явления вакуолизации нейронов (перстневидные клетки) встречаются редко и слабо выражены, тогда как при "скрепи" у овец они носят более выраженный характер;

- наличие вокруг нейронов явлений отека и вакуолизации;

24.1. подтвержденным на губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота диагноз следует считать только на основании комплексного анализа эпизоотологических, клинико-анатомических и патогистологических исследований. При этом следует сравнивать гистопрепараты отделов головного мозга, полученных от заведомо здоровых животных (контроль);

24.2. сомнительным считается диагноз при наличии асимметричных признаков вакуолизации в нейроглии или в нейронном околоядерном пространстве;

24.3. отрицательный диагноз ставится в случае отсутствия гистологических изменений в основных участках головного мозга, необходимых для диагностики, согласно приложениям 11 - 13), а при подозрении - и остальных участков мозга;

24.4. Дополнительными методами диагностики губкообразной энцефалопатии являются электронно-микроскопический метод, иммуноблотинг, а также иммуногистохимический метод выявления патологических PrP-белков в обычных, фиксированных в формалине срезах, который проводится Всероссийским научно-исследовательским институтом защиты животных (г.Владимир, Российская Федерация).

Глава 8. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЙ

25. Выявление (САФ) в тканях центральной нервной системы (далее - ЦНС) методом получения мазков-отпечатков осуществляется путем их изучения после воздействия на мазок различных ферментов и дальнейшего их просмотра под электронным микроскопом.

25.1. Исследования проводят в следующем порядке:

приготовление исходных концентрированных и рабочих растворов;

получение мазков-отпечатков;

обработка исследуемых проб;

контрастирование;

микроскопия;

учет результатов.

25.2. Оборудование, реактивы и приготовление растворов - согласно приложению 14.

25.3. Постановка реакции проводится в следующем порядке:

25.3.1. в исследуемой ткани мозга (лобная, височная, затылочная, теменная части коры полушарий большого мозга, кора мозжечка) делают срез длиной не менее 1 см;

25.3.2. электронно-микроскопические сеточки, покрытые фармваруглеродной подложкой, предварительно смоченные в бидистиллированной воде и / или 2-процентном растворе додецилсульфата натрия (далее - ДСН) в течение 1 минуты, помещаются на "свежий" срез мозга на 1 минуту;

25.3.3. в 3 чашки Петри вносят по 200 мкл растворов ДСН, трипсина и протеиназы К соответственно. Полученные на сеточках мазки-отпечатки накладывают отпечатком вниз в капли соответствующих растворов, накрывают крышкой, помещают в термостат и инкубируют в течение 30 минут при 37 град. С;

25.3.4. для каждого вида обработки используют по 4 электронно-микроскопические сеточки. Отдельные сеточки проводят последовательно через обработку всеми тремя реагентами;

25.3.5. после обработки сеточки промывают дистиллированной водой (5 раз по 30 секунд);

25.3.6. для контрастирования сеточки с мазками-отпечатками помещают в 5-процентный раствор уранил ацетата на 15 - 20 минут, затем интенсивно промывают под проточной дистиллированной водой и высушивают на фильтровальной бумаге;

25.3.7. исследование мазков-отпечатков проводят на электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 15000 - 60000;

25.3.8. учет результатов проводят путем сравнительного электронно-микроскопического изучения мазков-отпечатков мозга в сочетании с обработкой ДСН, трипсином и протеиназой К, что позволяет идентифицировать САФ из общего пула трубчато-филаментозных образований, выявляемых в ЦНС. При этом, чем более выражена "жесткость" ферментативной обработки, тем ниже вероятность ошибки и выше возможность обнаружения таких специфических фибриллярных структур.

После описанной обработки при электронно-микроскопическом обследовании сеточек в мазках-отпечатках сохраняются только аномальные филаментозные спиральные структуры - САФ, устойчивые к воздействиям, модифицирующим белковые макромолекулы. Обычно САФ представлены относительно однородной по морфологии популяцией: имеют диаметр 10 - 20 нм и состоят из нескольких (2 - 4) спирально закрученных протофиламентов, перекрещивающихся друг с другом через одинаковые интервалы 50 - 150 нм. Длина САФ может варьировать в зависимости от "жесткости" ферментативной обработки в пределах от 100 - 200 нм до 1,5 - 2 микрон. Реже PrP-структуры могут быть представлены отдельно лежащими глобулами, палочками и / или другими палочковидными структурами. Обнаружение протеазо-устойчивых структур свидетельствует о наличии прионовой инфекции в ЦНС.

26. Выявление прионовых палочек в тканях центральной нервной системы методом негативного контрастирования осуществляют путем их ферментативного выделения с последующим просмотром под электронным микроскопом.

26.1. Исследование проводят в следующем порядке:

приготовление исходных концентрированных и рабочих растворов;

обработка исследуемых проб (выделение и очистка белковых структур);

ферментативная обработка белковых структур;

контрастирование;

микроскопия;

учет результатов.

26.2. Оборудование, реактивы и приготовление растворов - согласно приложению 15.

26.3. Постановка реакции проводится в следующем порядке:

26.3.1. отбирают образец ткани головного мозга (лобная, височная, затылочная, теменная части коры полушарий большого мозга, кора мозжечка, подкорковые ядра) массой 5 г;

26.3.2. образцы мозга измельчают и тщательно гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса (20 тракций);

26.3.3. готовят 10% мозговую суспензию на растворе 1 согласно приложению 15 с добавлением 1 - 2 капель изопропанола и центрифугируют при 22000 x g, 30 минут, 4 град. С;

26.3.4. отбирают надосадочную жидкость и центрифугируют при 215000 x g, 2 часа, 4 град. С;

26.3.5. осадок гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса (20 тракций) и разводят раствором 2 в соответствии с приложением 15;

26.3.6. суспензию центрифугируют при 215000 x g, 2,5 часа, 4 град. С;

26.3.7. полученный осадок растворяют в том же растворе (раствор 2), добавляют протеиназу К до конечной концентрации 20 мкг/мл и инкубируют в течение 2 часов при 37 град. С;

26.3.8. после ферментативного протеолиза материал помещают в эппендорф и центрифугируют при 6000 оборотов/минуту, 15 мин при 4 град. С;

26.3.9. осадок разводят буфером STE, pH 7,4 и повторно центрифугируют при 6000 оборотов/минуту, 15 минут при 4 град. С;

26.3.10. подобную операцию желательно проводить еще 1 - 2 раза, при этом потери белка составляют не более 5 процентов;

26.3.11. результирующий осадок разводят в 50 мкл буфером STE, pH 7,4 и хранят до использования при -20 град. С;

26.3.12. аликвоту полученной суспензии (5 - 10 мкл) наносят на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваруглеродной подложкой, и инкубируют 1 минуту при комнатной температуре;

26.3.13. затем сеточки промывают дистиллированной водой (5 раз по 30 секунд);

26.3.14. для контрастирования сеточки помещают в 5% раствор уранил ацетата на 15 - 20 минут, затем интенсивно промывают под проточной дистиллированной водой и высушивают на фильтровальной бумаге;

26.3.15. исследование образцов проводят на электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 15000 - 60000;

26.3.16. учет результатов проводят после обработки, в исследуемых образцах центральной нервной системы сохраняются только аномальные PrP-структуры, в виде везикул, глобул, палочек и филаментов, состоящие из белка PrP27-32. Обычно PrP-структуры представлены относительно однородной по морфологии популяцией палочкообразных частичек диаметром от 10 до 25 нм и длиной от 100 - 200 до 500 нм. Выявление в исследуемых образцах аномальных PrP-структур позволяет судить о наличии прионовой инфекции в ЦНС.

27. Диагностика прионовых инфекций методом ультратонких срезов осуществляется путем обнаружения дегенеративно-деструктивных изменений в тканях ЦНС методом электронной микроскопии.

27.1. Исследование проводят в следующем порядке:

фиксация материала;

обезвоживание;

полимеризация;

ультрамикротомия;

контрастирование;

микроскопия;

учет результатов.

27.2. Оборудование, реактивы и приготовление растворов - согласно приложению 16.

27.3. Постановка реакции проводится в следующем порядке:

27.3.1. из ткани мозга (лобная, височная, затылочная, теменная, части коры полушарий большого мозга, кора мозжечка, подкорковые ядра и т.д.) вырезают кусочки объемом 0,5 куб.см и немедленно помещают в пробирку с 2,5% глутаровым альдегидом на 5 - 10 минут при 0 град. С;

27.3.2. извлеченные из глутарового альдегида кусочки мозга нарезают бритвенным лезвием на блоки объемом 1 куб.мм и снова помещают в 2,5% глутаровый альдегид на 2 часа при +4 град. С;

27.3.3. фиксированные кусочки мозга промывают в 3 сменах фосфатного буфера, охлажденного до +4 град. С, в течение 15 минут;

27.3.4. кусочки мозга дополнительно фиксируют в течение 1 часа в 1% OsO4;

27.3.5. для обезвоживания кусочки мозга помещают в 70% этанол по 10 минут 2 раза; 96% этанол - по 10 минут 2 раза; 100% этанол - по 20 минут 2 раза; ацетон - по 20 минут 2 раза;

27.3.6. обезвоженные кусочки мозга помещают в смесь аралдитов, разведенную равным объемом ацетона, на 12 часов при комнатной температуре;

27.3.7. кусочки мозга переносят 3 - 4 часа в смесь аралдитов с добавлением 4% дибутилфтолата;

27.3.8. кусочки мозга помещают в капсулы, заливают свежей смесью аралдитов на 24 часа при +70 град. С для полимеризации;

27.3.9. блоки с образцами затачивают в виде пирамидки бритвенным лезвием под контролем бинокулярной лупы;

27.3.10. срезы готовят на ультрамикротоме и помещают на опорные электронно-микроскопические сеточки;

27.3.11. для контрастирования сеточки со срезами помещают в 5% раствор уранил ацетата на 15 - 20 минут, затем интенсивно промывают под проточной дистиллированной водой и высушивают на фильтровальной бумаге;

27.3.12. в чашку Петри вносят каплю раствора цитрата свинца и рядом с каплей помещают 5 - 7 гранул NaOH или КОН;

27.3.13. электронно-микроскопическую сеточку помещают срезом вниз в каплю раствора на 15 - 20 минут, промывают водой и высушивают;

27.3.14. исследование ультратонких срезов проводят на электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кВ при увеличении 15000, 30000, 45000;

27.3.15. учет результатов при диагностике прионовой инфекции в ЦНС методом ультратонких срезов основывается на обнаружении дегенеративно-деструктивных изменений в нейронах головного, реже спинного, мозга, спонгиоза серого и белого вещества мозга, астроглиоза (гипертрофии астроцитов и их пролиферации) и амилоидоза (отложение амилоидных бляшек в стенках сосудов и паренхиме мозга). Обнаружение этих патогномических признаков заболевания свидетельствует о развитии прионовой инфекции в ЦНС.

Глава 9. ВЫЯВЛЕНИЕ ПРИОНОВОГО БЕЛКА PRP27-32 МЕТОДОМ

ИММУННОГО БЛОТИНГА

28. Исследование проводят в следующем порядке:

приготовление исходных концентрированных и рабочих растворов;

обработка исследуемых проб;

приготовление пластины 12% ДСН-полиакриламидного геля;

электрофорез прионов;

перенос PrP с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную бумагу и приготовление полос шириной 0,5 см;

обработка нитроцеллюлозных полос исследуемыми образцами ЦНС;

учет результатов.

28.1. Оборудование, реактивы и приготовление растворов - согласно приложению 17.

28.2. Постановка реакции осуществляется следующим обоазом:

28.2.1. концентрированный препарат PrP27-32 в объеме 100-120 мкл и содержанием белка 500 мкл (5 мг/мл) обрабатывают лизирующим буфером в количестве 1/4 от объема образца и вирусные белки разгоняются в додецилсульфате натрия - полиакриламидном геле (далее - ДСН-ПААГ) (электрофорез проводится по методу Лэммли). Электрофорез проводят в течение 16 - 18 часов при напряжении 40 В и силе тока 7 мА;

28.2.2. после окончания электрофореза гель осторожно снимается со стекла. С одного края обрезается полоска геля шириной 2 см для проверки качества разделения белков;

28.2.3. остальная часть геля замачивается на 30 минут в буфере для переноса, здесь же замачивается нитроцеллюлозный фильтр, крупнопористая фильтровальная бумага и поролоновые прокладки;

28.2.4. после истечения указанного периода времени готовится кассета для переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану. Для этого на поролоновую прокладку последовательно укладывают крупнопористый фильтр, нитроцеллюлозную бумагу, гель, фильтровальную бумагу и опять поролоновую прокладку. Вся кассета зажимается плотно между двумя пористыми пластинами из оргстекла;

28.2.5. кассета опускается в камеру для переноса (нитроцеллюлозная мембрана со стороны (+), гель со стороны (-), которая заливается тотчас буфером для переноса;

28.2.6. электрофорез проводят в течение 2 часов при напряжении 160 В и силе тока 550 мА;

28.2.7. после окончания электрофореза нитроцеллюлозные мембраны промываются в фосфатном буфере (далее - PBS) с 0,05% Твин-20 в течение 30 минут. С одного края мембраны отрезается полоска шириной 5 мм и окрашивается 0,2% амидо черным для проверки качества переноса;

28.2.8. нитроцеллюлоза высушивается на воздухе и хранится между листами фильтровальной бумаги при +4 град. С до использования.

Исследуемые образцы (лизаты мозга, селезенки) в разведении 1:10 в твин-фосфатном буфере (далее - TS-PBS) с 1% этилового спирта добавляют к стрипам шириной 5 мм и инкубируют при 16 - 18 град. С при комнатной температуре, стрипы отмывают 3 раза TS-PBS и инкубируют в течение 1 часа с коммерческими моноклональными антителами IgG при 37 град. С в TS-PBS. Затем стрипы опять трижды отмываются TS-PBS и реакция визуализируется путем добавления к стрипам субстрата (PBS - 0,5 мг/мл диаминобензидин и 0,5 мг/мл H2О2) до появления полос. Реакция останавливается промыванием стрипов под водопроводной водой. После высушивания стрипов на воздухе проводится учет результатов.

Выявление специфических полос в стрипах, соответствующих по электрофоретической подвижности контрольному образцу PrP, дает основание судить о наличии прионовой инфекции в ткани ЦНС. Отсутствие специфических PrP-полос в стрипах рассматривают как отрицательный результат.

Глава 10. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ ДИАГНОЗ

29. Губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота необходимо дифференцировать от бешенства, листериоза, болезни Ауески, нервной формы инфекционного ринотрахеита, злокачественной катаральной горячки, а также отравлений фосфорорганическими, хлорорганическими, ртутьорганическими соединениями, фосфидом цинка, мышьяком, поваренной солью.

Основными отличительными признаками от губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота являются короткий латентный период (от 5 до 15 дней), острое или подострое течение, повышение температуры тела, отказ от корма и другие симптомы, присущие указанным заболеваниям, биопроба, данные вирусологических, бактериологических и токсикологических исследований.

30. Бешенство - острая контагиозная болезнь различных видов животных и человека, характеризующаяся параличами, агрессией, водобоязнью.

Возбудитель - рабдовирус.

Бешенство крупного рогатого скота чаще протекает в буйной форме и характеризуется возбуждением, извращением аппетита, расширением зрачков, обильным слюноотделением. Агрессивность по отношению к человеку и животным наблюдается редко. К концу болезни развиваются параличи - спазм гортани и глотки, затем передних и задних конечностей. Смерть наступает на 3 - 6 день. При тихой форме бешенства симптомы возбуждения выражены в незначительной степени, но очень рано развиваются параличи.

Необходимо отметить, что прижизненная дифференциальная диагностика губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота и бешенства, несмотря на всю ее значимость, имеет лишь ориентировочное значение. Основное практическое значение имеет посмертная диагностика, основанная на данных морфологического, серологического исследования и биопробы.

Гистологические изменения головного и спинного мозга при бешенстве характеризуются рассеянным энцефаломиелитом, проявляющимся воспалительными изменениями сосудов и поражением нервных клеток. Указанные изменения для бешенства неспецифичны и при диагностике играют второстепенную роль согласно приложениям 18 и 19. Специфическим является обнаружение в цитоплазме нейронов головного мозга особых образований, названных тельцами Бабеша-Негри, наиболее часто они обнаруживаются в клетках аммонова рога, реже - в других отделах. Тельца Бабеша-Негри представляют собой полиморфные образования со сложной внутренней структурой: в середине одна или несколько плотных гранул, по периферии - более мелкие зернышки. Размеры телец колеблются от 0,25 - 1 до 20 - 25 микрон. В одной клетке может быть одно или несколько телец различной величины и формы согласно приложению 20.

Для обнаружения телец Бабеша-Негри в гистосрезах, мазках и отпечатках мозга предложено множество способов окраски последних: по Михину, Муромцеву, Манну, Ленцу, Адуцкевичу.

Из серологических методов исследования наиболее специфичным при бешенстве является метод флюоресцирующих антител, позволяющий выявлять при наличии вируса в мозгу специфическое свечение (разной величины и формы гранулы яркого желто-зеленого цвета величиной от едва заметных образований до 15 - 20 микрон).

При отрицательных результатах, полученных морфологическими и серологическими методами, для окончательной постановки диагноза проводится биологическая проба, основанная на заражении исследуемым материалом лабораторных животных, главным образом белых мышей. С этой целью суспензией мозга 1:10 с добавлением антибиотиков заражают в мозг 5 - 6 белых мышей весом 4 - 6 г в дозе 0,03 мл. Наблюдение за животными проводят в течение 14 дней. В случае падежа животных их мозг исследуют на наличие телец Бабеша-Негри. Если в течение 14 дней у зараженных животных не будут выявлены тельца Бабеша-Негри, то результат считается отрицательным.

31. Болезнь Ауески (псевдобешенство) - контиагиозная болезнь домашних и диких животных, в том числе и крупного рогатого скота, сопровождается поражением центральной нервной системы и органов дыхания.

Возбудителем является герпесвирус. Вирус обладает пантропностью, инкубационный период от 1 до 15 дней. У крупного рогатого скота вначале повышается температура тела до 41,9 град. С, прекращается жвачка, появляется сильный зуд в области ноздрей, губ, щек или глаз, реже - на других участках тела. Животные вялые, отказываются от корма, беспокоятся, непрерывно лижут зудящие места, трутся об окружающие предметы. Возбуждение нарастает, глаза выражают испуг, животное мычит, стонет, рвется с привязи (агрессивности не проявляет). Нередко наблюдаются судорожные сокращения жевательных и шейных мышц.

При вскрытии у животных расчесы в области головы, спины, конечностей. На месте расчесов кожа гиперемирована, края раны отечные, подкожная клетчатка геморрагически инфильтрирована. При гистологическом исследовании в мозгу отмечается картина негнойного менингоэнцефалита. Он характеризуется образованием диффузной и очаговой пролиферации клеток глии, периваскулярной инфильтрацией, клетками ретикулоэндотериального типа, вакуолизацией и пикнозом ганглиозных нервных клеток, нейрофагией, многорядовой пролиферацией клеток мозговых оболочек и боковых желудочков согласно приложениям 18 и 19.

Лабораторная диагностика болезни Ауески заключается в обнаружении и идентификации возбудителя болезни в патологическом материале (реакцией иммунофлуоресценции или иммуноферментного анализа), выделении вируса на культуре клеток с последующей его типизацией, а также обнаружении противовирусных антител в сыворотке крови от больных и переболевших животных в реакции непрямой гемагглютинации, иммуноферментном анализе, реакции нейтрализации.

32. Листериоз - инфекционная болезнь, протекающая с признаками сепсиса, поражения центральной нервной системы, половых органов и молочной железы.

Возбудителем инфекции является Listeria monocytogenes.

Инкубационный период длится 1 - 4 недели. Течение болезни бывает острое, подострое и хроническое. Листериоз может проявляться несколькими формами: нервной, септической, смешанной, бессимптомной или выражаться в виде поражения половых органов и молочной железы. У крупного рогатого скота и овец отмечается преимущественное поражение центральной нервной системы. Первые признаки характеризуются угнетением, снижением аппетита, в дальнейшем (1 - 7 дней) проявляются некоординированность движений, круговые движения, потеря равновесия, судороги, парезы отдельных групп мышц, потеря зрения, конъюнктивит, стоматит, оглумоподобное состояние, иногда приступы буйства. В начальной стадии болезни температура тела может быть несколько повышена или не превышать физиологической нормы, длительность болезни 7 - 10 дней и в большинстве случаев животные погибают.

При вскрытии у крупного рогатого скота отмечают острую венозную гиперемию и отек легких, гистогнойный энцефалит (стволовая часть головного мозга и шейная часть спинного мозга) согласно приложениям 21 и 22.

Диагноз на листериоз устанавливают на основе эпизоотологических, клинических, патологоанатомических и лабораторных методов исследований.

Основанием для постановки диагноза является выделение возбудителя на питательных средах, его идентификация, биопроба на белых мышах и кроликах. Для серологической диагностики используют сыворотки крови от больных и переболевших животных. Наличие антител выявляют в реакции агглютинации, реакции связывания комплемента, иммуноферментном анализе. Для ускорения диагностики используют люминесцентную микроскопию с использованием гипериммунной антилистериозной сыворотки, меченной флюорохромами.

33. Злокачественная катаральная горячка крупного рогатого скота - острая инфекционная болезнь крупного рогатого скота, характеризующаяся поражением слизистой оболочки головы, глаз и нервной системы.

Возбудитель - герпесвирус.

Начальная стадия заболевания характеризуется высокой температурой в течение 1 - 2 дней, воспалением слизистых оболочек ротовой и носовой полостей. Из носа появляются истечения слизистого, затем гнойно-кровянистого секрета. Повышенная температура тела (40 - 42 град. С) держится на постоянном уровне на протяжении болезни. Смерть может наступить через 24 часа, иногда через 2 недели и более. Летальность - 90%.

Патологоанатомические измерения зависят от тяжести и продолжительности заболевания и характеризуются катарально-гнойным конъюнктивитом и кератитом, некрозом эпидермиса носового зеркальца и слизистой оболочки ротовой полости, гнойно-фибринозным ринитом, ларингитом, крупозно-геморрагическим или дифтеритическим колитом. При гистологическом исследовании головного мозга - негнойный менингоэнцефалит согласно приложениям 18 и 19.

Методы диагностики основаны на выделении и идентификации вируса на культуре клеток и обнаружении специфических антител в реакции иммунодиффузии, реакции непрямой гемагглютинации или иммуноферментном анализе.

34. Инфекционный ринотрахеит - острое инфекционное заболевание крупного рогатого скота, характеризующееся поражением органов дыхания и пищеварения у молодняка и половых органов у взрослых животных, также менингоэнцефалитом у телят.

Возбудитель - герпесвирус.

Заболеваемость животных инфекционным ринотрахеитом зависит от локализации вируса, его вирулентности, возраста, пола и физиологического состояния животного. Отмечены респираторная, энтеральная, генитальная, конъюнктивальная и нервная формы течения инфекционного ринотрахеита. Наиболее часто встречается у новорожденных телят энтеральная форма, у телят старше 1 месяца - респираторная, конъюнктивальная, реже - нервная формы, у взрослых - генитальная форма.

Нервная или менингоэнцефалитная форма инфекционного ринотрахеита возникает у животных после проникновения вируса через гематоэнцефалический барьер. Ее наблюдают редко и, как правило, у молодняка 2 - 6 месяцев. Она характеризуется расстройством двигательных функций и нарушением равновесия. Болезнь сопровождается мышечным тремором, мычанием, скрежетом зубов, конвульсиями, слюнотечением.

На вскрытии у животных с менингоэнцефалитной формой инфекционного ринотрахеита в головном мозге гиперемия сосудов, отечность тканей и мелкие кровоизлияния. При гистологическом исследовании - хорошо выраженный лимфоцитарный менингоэнцефалит. Ему сопутствуют периваскулярная лимфоцитарная инфильтрация в различных отделах полушарий и мозжечка, сильная инъекция сосудов и отечность вещества мозга. У животных, которые погибают, в веществе мозга преобладают кровоизлияния, а при затяжном течении болезни - дегенеративные изменения нервных клеток и клеточно-пролиферативные процессы глиальных элементов согласно приложениям 18 и 19.

Диагноз на инфекционный ринотрахеит ставят путем выделения и идентификации вирусов на культуре клеток, обнаружения противовирусных антител в сыворотках крови больных и переболевших животных в реакции нейтрализации, реакции непрямой гемагглютинации или иммуноферментном анализе.

35. Отравление мочевиной характеризуется сильным угнетением, потливостью, атаксией, слюнотечением, клоническими и тетаническими судорогами. Отравлению подвержены в основном взрослые животные. Температура тела в норме. Заболевают единичные животные до 30 - 40-процентного поражения стада.

На вскрытии - геморрагический гастроэнтерит, вздутие рубца (при разрезе ощущается резкий запах аммиака), зернистая (жировая) дистрофия печени и некрозы в ней. Основанием для постановки диагноза являются лабораторные исследования содержимого рубца на наличие в нем мочевины.

36. Отравление ртутьорганическими соединениями характеризуется резким угнетением, сильной саливацией, поносом, полиурией, угнетением сердечной деятельности, атаксией, парезами, параличами. Температура тела в норме. Заболевают единичные животные до массовых случаев поражения стада.

На вскрытии - серозно-катаральный гастроэнтерит, некротический некроз, зернистая (жировая) дистрофия миокарда и печени, крупозно-дифтеретический колит, кровоизлияния в серозных оболочках пищеварительного тракта.

Основанием для постановки диагноза являются лабораторные исследования содержимого рубца на наличие в нем соединений ртути.

1 2 3 4 5 6

|