|
|
|
|
|
|
|
Постановление Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь, Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 13.03.2001 N 9/15 "Об утверждении нормативных правовых актов по борьбе с губкообразной энцефалопатией крупного рогатого скота"(текст документа по состоянию на январь 2010 года. Архив) обновление Стр. 5 ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАКТИВЫ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГУБКООБРАЗНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ УЛЬТРАТОНКИХ СРЕЗОВ Оборудование 1. Электронный микроскоп (JEM-IOO CX, Япония) 2. Ультрамикротом (Reichert, Австрия) 3. Прибор для приготовления стеклянных ножей (Inifemaker, Австрия) 4. Желатиновые или полистирольные капсулы (желатиновые - РФ, полистирольные - Beem, США) 5. Электронномикроскопические сеточки (Balzera, Union) на 100 или 50 ячеек 6. Иономер (pH-метр) 7. Автоматические пипетки с переменным объемом на 0,02 мл; 1,0 мл 8. Наконечники к автоматическим пипеткам на 0,02 мл; 1,0 мл 9. Бритвенные лезвия "Нева" 10. Бинокулярная лупа МБС-9, РФ 11. Лабораторная посуда 12. Весы аналитические 13. Термостат Реактивы 1. Этиловый спирт (этанол) (ГОСТ 18300-87) 2. Метиловый спирт (метанол) (М3641, Sigma) 3. Глутаральдегид (G6257, Sigma) 4. Ацетон (ГОСТ 2603-79) 5. Аралдит (964), Serva 6. Аралдит (212), Serva 7. Арендит 0,64 - катализатор, Serva; 8. Дибутилдифтолат - пластификатор, Serva; 9. Уранил ацетат, Serva 10. Цитрат свинца, Serva 11. Тотрат калия, Serva 12. Едкий натр (NaOH) (ГОСТ 4328-77) 13. Натрий фосфорнокислый (NaHPO4 и Na2НРО4 х 2Н20) (ГОСТ 4172-76) 14. Тетраоксид осмия OsO4 (О5500, Sigma) Приготовление растворов Все растворы готовятся на бидистиллированной воде. 1. 70% этанол (100 мл 96 град. этанола + 28 мл Н2О). 2. 100% этанол хранится в посуде с селикогелем или получают из 96 град. этанола путем обезвоживания (100 мл 96 град. этанола + 20 г CuSO4 х 5Н2О, прожженного при 100 град. С в течение 30 - 40 мин). 3. 2,5% глутаральдегид (10 мл 25% глутаральдегида + 90 мл фосфатного буфера). 4. Смесь аралдитов. Равные объемы (20 мл) аралдита 964 и аралдита 212 тщательно перемешивают, предварительно нагрев до 60 град., добавляют 0,8 мл аралдита 964 и 1,2 мл дибутилфтолата и вновь тщательно перемешивают в течение 20 - 30 минут. 5. 5% уранил ацетат (0,5 мл уранил ацетата + 7 мл метанола + 3 мл Н2О). 6. Раствор цитрата свинца (40 мг NaOH растворить в 10 мл Н2О + 20 мл тортрата калия + 40 мг цитрата свинца). 7. 1% тетраоксид осмия (1,3 г тетраоксида осмия растворить в 50 мл Н2О и хранить в темном месте). Перед употреблением добавить 50 мл фосфатного буфера. 8. Фосфатный буфер pH 7,2 (28 мл 0,2 М NaH2РО4 + 72 мл 0,2 М Na2НРО4). Приложение 17 к Инструкции по диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАКТИВЫ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГУБКООБРАЗНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ИММУНОБЛОТИНГА Оборудование 1. Автоматические пипетки с переменным объемом на 1 мл, 0,2 мл и 0,02 мл 2. Наконечники к пипеткам 1 мл и 0,2 мл 3. Пластиковые центрифужки одноразового применения на 1,5 мл 4. Центрифуга настольная типа ОПН-8 5. Центрифуга лабораторная типа ЦЛР 6. Холодильник бытовой с морозильной камерой -18 град. С ("Минск-15") 7. Лабораторная посуда 8. pH-метр 9. Источник тока (ПЭФ-3, УИП-2) 10. Прибор для вертикального электрофореза 11. Герметичные коробки для фиксации и окраски гелей 12. Прибор для переноса белков с ДСН-ПААГ на нитроцеллюлозные мембраны 13. Герметичные коробки для обработки нитроцеллюлозных мембран 14. Целлофановая пленка 15. Фильтровальная бумага 16. Термостат 17. Водяная баня 18. Весы технические 10 - 200 г 19. Весы аналитические 20. Аппарат для встряхивания АВЧ-6С (РФ) Реактивы 1. Трис-(гидрооксиметил)-аминометан (ТУ 6-09-4292-76) 2. HCl концентрированная (ГОСТ 3118-77) 3. Глицин (ГОСТ 5860-75) 4. Акриламид (ТУ 6-09-14-1576-73) 5. Метиленбисакриламид (ТУ 6-09-10-1234-77) 6. Додецилсульфат натрия (ТУ 6-09-06-805-76) 7. Аммония персульфат (ГОСТ 20478-75) 8. TEMED (N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин) (T9281, Sigma) 9. Бромфеноловый синий (ТУ11П-282-71; ТУ 6-09-4530-77) 10. В-меркаптоэтанол (ТУ 6-09-08-1024-75) 11. Глицерин (ГОСТ 6259-75) 12. Мочевина (ГОСТ 6691-77) 13. Этиловый спирт C2H5OH (ГОСТ 18300-87) 14. Уксусная кислота ледяная (ГОСТ 61-75) 15. Глицерин (ГОСТ 6259-75) 16. Амидо черный 10В (N3393, Sigma) 17. Мембрана нитроцеллюлозная "Миллипор"-НА (Франция, "Schleicher & Schuell" ВАД-0,45 мкм; ФРГ, ВА-85-0,45 мкм) 18. Твин-20 (P7949, Sigma) 19. Бычий сывороточный альбумин (A2153, Sigma) 20. 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорид (D7304, Sigma) 21. Моноклональные антитела к иммуноглобулинам крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена 22. Положительные и отрицательные контрольные сыворотки Приготовление растворов Все растворы готовят на бидистиллированной воде. 1. Раствор мономеров: 45 г акриламида; 1,2 г N,N-метиленбисакриламида и 0,15 г ДСН растворяют в 105 мл Н2О, фильтруют. 2. Буфер для разделительного геля: 13,6 г трис, 0,2 г ДСН растворяют в 180 мл Н2О, доводят концентрированной HCl до pH 8,8, объем доводят H2О до 200 мл. 3. Буфер для фокусирующего геля: 1,68 г трис, 0,1 г ДСН растворяют в 90 мл Н2О, доводят концентрированной HCl до pH 6,8 (осторожно) и доводят H2О до 100 мл. 4. Электродный буфер, 10-кратный: 144 г глицина, 10 г ДСН растворяют в 900 мл Н2О, доводят сухим трисом (10 г) до pH 8,3 и общий объем - до 1 л. 5. Лизирующий буфер: 10 мл буфера для фокусирующего геля (pH 6,8), 5 мл - b-меркаптоэтанола, 2 г ДСН и 5 мл Н2О. Лизирующий буфер добавляют к пробе в количестве 1/4 от объема образца. 6. Маркерная краска: 200 мг "бромфенолового голубого" растворяют в буфере для образца, добавляют 50 мг глицерина, объем доводят до 100 мл. 7. Буфер для образца: 0,84 г трис растворяют в 90 мл Н2О, доводят концентрированной HCl до pH 6,8 и Н2О до 100 мл. 8. Разделительный гель. Для приготовления 10% разделительного геля смешивают 10 мл раствора мономеров, 20 мл буфера для разделительного геля (для приготовления 12% разделительного геля берут соответственно 12 мл и 18 мл). Добавляют 0,015 мг персульфата аммония и 0,075 мл TEMED в разведении 1/10. Смесь перемешивают и заливают в пластину для электрофореза. Сверху осторожно наслаивают 1 мл дистиллированной воды и оставляют при комнатной температуре. О завершении полимеризации геля судят по появлению четкого раздела между гелем и водой. После завершения полимеризации воду сливают и поверхность геля осторожно осушают фильтровальной бумагой. 9. Фокусирующий гель, 5%. Смешивают 1,5 мл раствора мономеров и 9 мл буфера для фокусирующего геля, добавляют 6 мг персульфата аммония и 0,05 мл TEMED в разведении 1/10. 10. Буфера для переноса: буфер А: 0,3 М трис pH 10,4; буфер Б: 25 мМ трис pH 10,4; буфер В: 40 мМ аминокапроновая кислота, 25 мМ трис pH 9,4. 11. Трис-буфер pH 7,4 (ТБ), 10-кратный сток-раствор: 6,05 г трис, 0,5 г азида натрия и 45 г хлористого натрия. Растворяют в 400 мл H2О, доводят pH до 7,4 концентрированной HCl. Доводят объем буфера до 500 мл. 12. Промывочный буфер. Смешивают 10 мл 10-кратного сток-раствора ТБ и 90 мл H2О. Добавляют 50 мкл Твин-20, перемешивают. 13. Блокирующий раствор: 1 г БСА растворяют в 50 мл H2О, добавляют эмбриональную сыворотку 10 мл и 10 мл 10-кратного ТБ. Объем доводят до 100 мл H2О, перемешивают. 14. Раствор субстрата: 10 мл 10-кратного ТБ и 90 мл H2О. Вносят 30 мг бензидина, смесь нагревают на водяной бане до полного растворения диаминобензидина, охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,1 мл 30% H2О2. Раствор субстрата готовят непосредственно перед использованием. Приложение 18 к Инструкции по диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота НЕГНОЙНЫЙ ЭНЦЕФАЛИТ ***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ Диффузная инфильтрация круглоклеточными элементами нейроглии, сглаживание структуры мозга, вакуолизация отсутствует (окраска гематоксилинэозином, 300x) Приложение 19 к Инструкции по диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота НЕГНОЙНЫЙ ЭНЦЕФАЛИТ ***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ Диффузная инфильтрация круглоклеточными элементами нейроглии, сглаживание структуры мозга, вакуолизация отсутствует (окраска гематоксилинэозином, 600x) Приложение 20 к Инструкции по диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота БЕШЕНСТВО ***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ Наличие в аммоновом рогу патогномоничных оксифильных (красных) округлых телец Бабеша-Негри (окраска по Муромцеву, 600x) Приложение 21 к Инструкции по диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота ГНОЙНЫЙ ЭНЦЕФАЛИТ ПРИ ЛИСТЕРИОЗЕ ***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ Цитокариопикноз и лизис нейронов, диффузная инфильтрация нейроглии лимфоидными и частично нейтрофильными элементами (окраска гематоксилинэозином, 300x) Приложение 22 к Инструкции по диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота ГНОЙНЫЙ ЭНЦЕФАЛИТ ПРИ ЛИСТЕРИОЗЕ ***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ Цитокариопикноз и лизис нейронов, диффузная инфильтрация нейроглии лимфоидными и частично нейтрофильными элементами (окраска гематоксилинэозином, 300x) Приложение 23 к Инструкции по диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота  |  |
|
|
|