Постановление Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 13.08.2008 N 130-А "Об утверждении Санитарных норм, правил и гигиенических нормативов "Гигиенические требования к безопасности парфюмерно-косметической продукции, ее производству и реализации"

(текст документа по состоянию на январь 2010 года. Архив) обновление

Стр. 50

12.2. Проведение анализа.

12.2.1. Метод глубинного посева.

Исследуемый материал в количестве 1 куб.см из соответствующего разведения (или 1 куб.см нативного продукта в жидкой форме) вносят стерильной пипеткой в две параллельные чашки Петри и не позже, чем через 15 мин заливают расплавленной и охлажденной до (45 +/- 1) °C средой Сабуро по п. 5.2.1 в количестве (10 - 15) куб.см. Быстро перемешивают, аккуратно вращая чашку по поверхности стола.

После застывания среды чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (24 +/- 1) °C в течение (120 +/- 3) часов.

12.2.2. Двухслойный агаровый метод.

Исследуемый материал в количестве 1 куб.см из соответствующего разведения (или 1 куб.см нативного продукта в жидкой форме) вносят стерильной пипеткой в две пробирки с 4 куб.см предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45 +/- 1) °C агаризованной среды Сабуро. Быстро перемешивают содержимое пробирок и переносят в две параллельные чашки Петри с застывшей агаризованной средой Сабуро, распределяя его равномерно по поверхности среды.

После застывания чашки перемещают в термостат вверх дном и термостатируют при температуре (24 +/- 1) °C в течение (120 +/- 3) часов.

12.3. Обработка и выражение результатов.

Предварительный учет типичных колоний проводят через (72 +/- 3) часа термостатирования посевов, а окончательный - через (120 +/- 3) часов. Результаты оцениваются по каждой пробе отдельно.

На поверхности плотной среды рост и развитие дрожжей характеризуется появлением плоских или выпуклых колоний белого или кремового, иногда серо-белого цвета. В глубине агара дрожжи образуют чечевицеобразные колонии.

Развитие плесневых грибов характеризуется появлением сметанообразных, слизистых колоний различной окраски с последующим опушением.

Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 5 до 150 колоний дрожжей и плесневых грибов, колонии суммируют и вычисляют среднее арифметическое значение из посевов одного разведения.

Допускается учитывать колонии с помощью лупы с пятикратным увеличением.

Полученное среднее арифметическое число колоний округляют как описано в п. 11.3.

Общее количество плесневых грибов и дрожжей (X) вычисляют по формуле:

                                    a x 10

                                X = -------

где a - округленное среднее арифметическое число колоний;

     q - объем посевного материала, внесенного в чашки, куб.см;

     N - степень десятикратного разведения образца продукта.

     Результаты  анализа  выражают  числом (от 1,0 до 9,9) x 10 , где "N" -

соответствующая степень десятикратного разведения продукта.

     Если среднее арифметическое значение числа колоний дрожжей и плесневых

грибов меньше 5, то результаты выражают следующим образом: общее количество

плесневых грибов и / или дрожжей меньшее 5 умножают на --- КОЕ/г (куб.см).

Если на чашках с разведением 1:10 не обнаружено роста плесневых грибов и дрожжей, то результат записывают так: "не обнаружены".

Если на чашках выросло более 150 колоний дрожжей и плесневых грибов, то учитывают результаты на чашках с последующим разведением.

13. Выделение и идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae.

13.1. Сущность метода.

Метод основан на выявлении бактерий семейства Enterobacteriaceae с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.

К семейству Enterobacteriaceae относятся грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и восстанавливают нитраты в нитриты.

13.2 Проведение анализа.

Подготовленный образец в количестве 10 куб.см (или 1 куб.см нативного продукта в жидкой форме) вносят стерильной пипеткой во флакон с 90 куб.см (9 куб.см для нативного продукта в жидкой форме) одной из питательных сред, приготовленных по п. 5.3. При нормировании отсутствия бактерий семейства Enterobacteriaceae в 10 г продукции вносят 10 г образца в нативном виде во флакон с 90 куб.см одной из питательных сред, приготовленных по п. 5.3.

Содержимое перемешивают и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 - 48 +/- 3) часов. При наличии признаков роста на средах (помутнение среды, изменение ее цвета) делают пересев петлей обогащенной культуры на среду Эндо, разлитую в две стерильные чашки Петри в количестве (10 - 15) куб.см, которые инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 - 48 +/- 2) часов.

Если после инкубации на среде Эндо отмечен рост колоний темно-красного цвета с металлическим блеском и без него или розовых, бесцветных, выпуклых, диаметром (2 - 4) мм, т.е. подозрительных на принадлежность к семейству Enterobacteriaceae, проводят подтверждающие идентифицирующие тесты.

Петлей снимают подозрительные колонии (каждую отдельно) и готовят мазки на предметных стеклах для окраски по Граму. Мазки фиксируют трехкратным проведением над пламенем. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги, на нее наливают пипеткой (0,5 - 1,0) куб.см карболового раствора генциана фиолетового на 1 мин. Затем бумагу снимают, на препарат пипеткой наливают (0,5 - 1,0) куб.см раствора Люголя, выдерживают в течение 1 мин, препарат тщательно промывают спиртом этиловым ректификатом, затем - водой дистиллированной и докрашивают (1 - 2) мин раствором Фуксина Циля, предварительно разведенным водой дистиллированной в объемном соотношении 1:10. Учитывают наличие грамотрицательных неспорообразующих палочек (окрашенных в розовый цвет).

Колонии, выросшие на среде Эндо, подозрительные по морфологии (каждую отдельно), пересевают петлей на одну из скошенных сред по п. 5.1. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.

Полученные чистые культуры наносят штрихом на фильтровальную бумагу, предварительно смоченную реактивом для определения цитохромоксидазы. В месте внесения бактериальной массы бумага не изменяет цвета, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 2 - 5 мин, если бактерии обладают оксидазой активностью.

Культуры пересевают петлей на среду для определения ферментации глюкозы, приготовленную по п. 5.4.2 (допускается проведение O/F-теста). В половину пробирок со средой для определения ферментации глюкозы вносят 0,5 куб.см стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) часов. При наличии роста ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды из красного в желтый в пробирках с маслом и без него.

При проведении O/F-теста посев производят уколом в два столбика со средой Хью-Лейфсена, приготовленной по п. 5.4.4, один из которых заливают 1 куб.см стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) часов. При положительной реакции происходит изменение цвета среды из зеленого в желтый при культивировании, как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

Параллельно исследуемые культуры пересевают петлей на среду для определения способности восстанавливать нитраты в нитриты, приготовленную по п. 5.4.3. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) часов. О наличии нитритов в среде судят по появлению красного окрашивания при внесении в среду реактива Грисса (по п. 4.6). К суточной культуре на среде для определения способности восстанавливать нитраты в нитриты приливают (0,2 - 0,3) куб.см реактива Грисса, погружая пипетку до дна пробирки. Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитратов.

13.3. Обработка и выражение результатов

Если в исследуемом образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и восстанавливают нитраты в нитриты, это значит, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано бактериями семейства Enterobacteriaceae. Результат выражают следующим образом: в М г (куб.см) продукта обнаружены бактерии семейства Enterobacteriaceae (условное обозначение - "Enterob. обн."), где М - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии семейства Enterobacteriaceae.

В исследуемом образце парфюмерно-косметического средства бактерии семейства Enterobacteriaceae отсутствуют, если при визуальном контроле на чашках с соответствующими средами после инкубации не обнаруживают колоний с характерной морфологией (см. п. 13.2). Результат выражают следующим образом: в Мг (куб.см) продукта бактерии семейства Enterobacteriaceae не обнаружены (условное обозначение - "Enterob. н.о."), где М - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии семейства Enterobacteriaceae.

14. Выделение и идентификация бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

14.1. Сущность метода.

Метод основан на выявлении бактерий вида Pseudomonas aeruginosa с использованием накопительных и селективных питательных сред с последующей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.

Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa представляют собой грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают положительную оксидазную реакцию, образуют проникающий в субстрат пигмент феназинового ряда, имеющий буроватый оттенок с вариантами от сине-зеленого (пиоцианин) до коричнево-красного, и способны к росту при температуре (42 +/- 1) °C.

14.2. Проведение анализа.

Подготовленный образец в количестве 10 куб.см (или 1 куб.см нативного продукта в жидкой форме) вносят стерильной пипеткой во флакон с 90 куб.см (9 куб.см для нативного продукта в жидкой форме) одной из питательных сред, приготовленных по п. 5.5. При нормировании отсутствия бактерий вида Pseudomonas aeruginosa в 10 г продукции вносят 10 г образца в нативном виде во флакон с 90 куб.см одной из питательных сред, приготовленных по п. 5.5.

Содержимое перемешивают и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 - 48 +/- 3) часов. При наличии признаков роста в среде делают пересев обогащенной культуры петлей на одну из сред по п. 5.1, инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 - 48 +/- 3) часов.

При наличии роста характерных колоний, обладающих специфическим неприятным запахом, выделяющих сине-зеленый пигмент пиоцианин, колонии микроскопируют и исследуют на наличие фермента цитохормоксидазы.

При микроскопировании мазков, окрашенных по Граму по п. 13.2, учитывают наличие грамотрицательных неспорообразующих палочек.

Колонии, подозрительные по морфологии (каждую отдельно), пересевают петлей на одну из скошенных сред по п. 5.1. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.

Выросшие культуры наносят штрихом на фильтровальную бумагу, предварительно смоченную реактивом для определения цитохромоксидазы. В месте внесения бактериальной массы бумага не изменяет цвета, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 2 - 5 мин., если бактерии обладают оксидазой активностью.

Оксидазоположительные колонии пересевают на среду Кинг-А (по п. 5.6) и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 - 48 +/- 3) часов. На среде Кинг-А бактерии вида Pseudomonas aeruginosa образуют пигмент феназинового ряда, имеющий буроватый оттенок с вариантом от сине-зеленого (пиоцианин) до коричнево-красного и проникающий в субстрат.

Для дополнительного подтверждения принадлежности к виду Pseudomonas aeruginosa чашки со средой Кинг-А инкубируют при температуре (42 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) часов. Культура Pseudomonas aeruginosa растет в вышеуказанных условиях с образованием сине-зеленого пигмента.

14.3. Обработка и выражение результатов.

Если в результате исследований обнаружены колонии грамотрицательных неспорообразующих палочек, дающих положительную оксидазную реакцию, образующие пигмент или без него и дающие рост при 42 °C, считают, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано Pseudomonas aeruginosa. Результат выражают следующим образом: в М г (куб.см) продукта обнаружены бактерии вида Pseudomonas aeruginosa (условное обозначение - "Ps. аerug. обн."), где М - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии вида Pseudomonas aeruginosa.

В исследуемом образце парфюмерно-косметического средства бактерии вида Pseudomonas aeruginosa отсутствуют, если при визуальном контроле на чашках со средами после инкубации не обнаруживают характерных по морфологии колоний (см. п. 14.2). Результат выражают следующим образом: в М г (куб.см) продукта бактерии вида Pseudomonas aeruginosa не обнаружены (условное обозначение - "Ps. аerug. н.о."), где М - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии вида Pseudomonas aeruginosa.

15. Выделение и идентификация бактерий вида Staphylococcus aureus.

15.1. Сущность метода.

Метод основан на выявлении бактерий вида Staphylococcus aureus с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.

Бактерии вида Staphylococcus aureus представляют собой грамположительные кокки, обладающие лецитиназной активностью, сбраживающие маннит в аэробных и анаэробных условиях или мальтозу в анаэробных условиях и дающие положительную реакцию плазмокоагуляции.

15.2. Проведение анализа.

Подготовленный образец в количестве 10 куб.см (или 1 куб.см нативного продукта в жидкой форме) вносят стерильной пипеткой во флакон с 90 куб.см (9 куб.см для нативного продукта в жидкой форме) одной из питательных сред, приготовленной по п. 5.7. При нормировании отсутствия бактерий вида Staphylococcus aureus в 10 г продукции вносят 10 г образца в нативном виде во флакон с 90 куб.см одной из питательных сред, приготовленных по п. 5.7.

Содержимое перемешивают и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 - 48 +/- 3) часов. При наличии признаков роста делают пересев обогащенной культуры петлей на одну из следующих сред: желточно-солевой агар (по п. 5.8.1), Байрд-Паркер агар (по п. 5.8.2), маннитно-солевой агар (по п. 5.8.3). Посевы на желточно-солевом агаре и Байрд-Паркер агаре инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (48 +/- 3) часов, а посевы на маннитно-солевом агаре - (24 - 48 +/- 3) часов.

При росте на желточно-солевом агаре бактерии вида Staphylococcus aureus образуют круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара колонии с ровными краями диаметром 2 - 2,5 мм, окрашенные в желтый, золотистый, кремовый, палевый или белый цвет, окруженные зоной лецитиназной активности.

На среде Байрд-Паркер бактерии вида Staphylococcus aureus растут в виде черных блестящих колоний диаметром 1 - 1,5 мм, окруженных зоной лецитиназной активности.

Наличие на маннитно-солевом агаре колоний, окруженных желтыми зонами, свидетельствует о способности этих микроорганизмов ферментировать маннит.

При наличии характерных колоний производят микроскопию и при необходимости исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы.

Из подозрительных по морфологии колоний делают мазки и окрашивают по Граму. Стафилококки по Граму окрашиваются положительно, имеют шарообразную или близкую к ней форму с диаметром (0,6 - 1,0) мкм и располагаются обычно в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.

Отсутствие в мазках грамположительных кокков, окрашенных в сине-фиолетовый цвет и расположенных скоплениями в виде гроздьев, свидетельствуют об отсутствии стафилококков. В этом случае дальнейшие исследования не проводят.

При обнаружении грамположительных кокков делают пересев на одну из скошенных сред, приготовленных по п. 5.1. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) часов. Выделенную чистую культуру пересевают на среду Гисса с маннитом или мальтозой, приготовленную по п. 5.8.4, разлитую высоким столбиком (посев производят уколом). Инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) часов. В случае роста стафилококков на среде Гисса с маннитом или мальтозой наблюдается ферментация или окисление углевода, сопровождающиеся изменением цвета среды.

Выделенную чистую культуру исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы. Для проведения реакции сухую кроличью цитратную плазму разводят согласно наставлению по применению и разливают по 0,5 куб.см в четыре стерильные пробирки. В пробирки с раствором плазмы вносят по одной петле исследуемой суточной культуры с каждой пробирки со средой, приготовленной по п. 5.1 и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (4 - 6) часов. Обязательна постановка двух параллельных контролей: первый контроль - пробирка только с раствором плазмы; второй контроль - пробирка с раствором плазмы, в которую внесена суточная культура стафилококка, заведомо обладающего ферментом коагулазой. Если в эти сроки не наблюдается свертывание плазмы в опытной и первой контрольных пробирках, то реакция плазмокоагуляции считается отрицательной, если плазма в опытной пробирке коагулирована аналогично второму контролю, то реакция считается положительной.

15.3. Обработка и выражение результатов.

Если в результате исследований обнаружены колонии грамположительных кокков, ферментирующие маннит в аэробных и анаэробных условиях или мальтозу в анаэробных условиях, обладающие лецитиназной активностью и дающие положительную реакцию плазмокоагуляции, считают, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано Staphylococcus aureus. Результат выражают следующим образом: в М г (куб.см) продукта обнаружены бактерии вида Staphylococcus aureus (условное обозначение - "St. аur. обн."), где М - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии вида Staphylococcus aureus.

В исследуемом образце парфюмерно-косметического средства бактерии вида Staphylococcus aureus отсутствуют, если при визуальном контроле на чашках со средами после инкубации не обнаруживают характерных по морфологии колоний (см. п. 15.2) или при выявлении подозрительных колоний микроскопией не подтверждают наличие грамположительных кокков. Результат выражают следующим образом: в М г (куб.см) продукта бактерии вида Staphylococcus aureus не обнаружены (условное обозначение - "St. аur. н.о."), где М - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии вида Staphylococcus aureus.

16. Испытание парфюмерно-косметической продукции на стерильность.

16.1. Метод прямого посева.

Метод основан на способности большинства аэробных и анаэробных бактерий давать видимый рост на тиогликолевой среде, а плесневых грибов и дрожжей - на среде Сабуро.

Из объединенной пробы, приготовленной по п. 8, отбирают стерильно (10,0 +/- 0,1) г (куб.см) испытуемого средства и высевают в два стеклянных флакона (параллельные определения), содержащие 90 куб.см жидкой среды Сабуро, приготовленной по п. 5.2.2 и 90 куб.см тиогликолевой среды, приготовленной по п. 5.9 соответственно.

Посевы в среде Сабуро инкубируют при температуре (24 +/- 1) °C, а посевы в тиогликолевой среде при температуре (30 +/- 1) °C в течение 14 сут. Посевы просматривают ежедневно.

16.2. Метод мембранных фильтров.

Метод мембранных фильтров основан на фильтрации растворов через мембранные фильтры с размером пор не более (0,45 +/- 0,02) мкм, на которых улавливается основное количество микроорганизмов, с последующим культивированием их в тиогликолевой среде и в жидкой среде Сабуро.

Фильтрование проводят в стерильных условиях с использованием фильтрационной установки.

Для фильтрации используют нитратцеллюлозные мембранные фильтры с размером пор (0,45 +/- 0,02) мкм, диаметром около 47 мм (мембрана "Владипор" типа МФАС-Б5 или МФА-МА-N 5, Millipore, или другие, удовлетворяющие этим требованиям).

Фильтрование проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 мм рт.ст).

Для фильтрования образцов, содержащих небольшое количество взвешенных веществ, используют предварительную фильтрацию через префильтр. В качестве префильтров можно использовать фильтры типа АР 15 (Millipore), картон для предварительной фильтрации марки КФБЖ, картон для предварительной фильтрации марки КФМП и другие материалы, способные эффективно задерживать твердые частицы.

Пробу, подготовленную по п. 8 немедленно фильтруют. Фильтрацию заканчивают в момент исчезновения влаги на поверхности фильтра. После окончания фильтрации мембрану отмывают 3 - 5 порциями по 100 куб.см стерильного физиологического раствора для полного удаления с поверхности фильтра веществ, препятствующих росту микроорганизмов.

После отмывания мембрану немедленно извлекают из фильтродержателя, разрезают стерильными ножницами пополам и одну половину помещают в стеклянный флакон, содержащий 100 куб.см жидкой среды Сабуро, приготовленной по п. 5.2.2, а вторую половину - в стеклянный флакон, содержащий 100 куб.см тиогликолевой среды, приготовленной по п. 5.9 соответственно.

Посевы в среде Сабуро инкубируют при температуре (24 +/- 1)°C, а посевы в тиогликолевой среде при температуре (30 +/- 1)°C в течение 7 сут.

16.3. Обработка результатов.

Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов в питательных средах оценивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и других макроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов подтверждают микрокопированием.

Испытуемая продукция считается стерильной при отсутствии роста микроорганизмов.

При обнаружении роста хотя бы в одном флаконе его подтверждают микроскопированием и повторяют испытание на таком же количестве образцов, как и в первый раз. В случае роста при повторном испытании микроорганизмов, морфологически сходных с микроорганизмами, выявленными при первичном посеве, испытуемую продукцию считают нестерильной.

Если при повторном посеве наблюдается рост микроорганизмов, отличающихся по морфологии от первоначально выделенных, испытание проводят в третий раз на удвоенном количестве образцов. При наличии роста хотя бы в одном флаконе при третьем испытании косметическую продукцию считают нестерильной.

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. Настоящие санитарные правила разработаны ГУ "Республиканский научно-практический центр гигиены" Министерства здравоохранения Республики Беларусь (Г.И. Эрм, В.В. Шевляков, Е.В. Чернышова, Т.С. Трешкова, Л.А. Мельникова);

ГУ "Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья" (Л.И. Карпук, А.М. Лебедева).

2. Утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 13 августа 2008 N 130.

3. Введены взамен санитарных правил и норм:

N 10-33-95 "Санитарные правила и гигиенические нормативы безопасности парфюмерно-косметической продукции", утвержденные Главным государственным санитарным врачом Республики Беларусь 26 декабря 1995 г.;

N 10-33.1-95 "Методические указания по лабораторной гигиенической оценке безопасности реализуемой и применяемой парфюмерно-косметической продукции", утвержденные Главным государственным санитарным врачом Республики Беларусь 26 декабря 1995 г.;

N 10-33.2-95 "Методические указания по определению токсикологических и аллергологических нормативных показателей гигиенической безопасности реализуемой и применяемой парфюмерно-косметической продукции", утвержденные Главным государственным санитарным врачом Республики Беларусь 26 декабря 1995 г.;

N 10-33.3-96 "Методические указания по определению нормативных показателей микробиологической чистоты косметической продукции", утвержденные Главным государственным санитарным врачом Республики Беларусь 21 марта 1996 г.

Приложений NN 1 - 7 к СанПиН 10-64 РБ 98 "Гигиенические требования к производству, кчеству и безопасности средств гигиены полости рта", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 29 апреля 1998 г. N 18.

В Приложении 3 к СанПиН 1.1.12-14-2003 "Гигиенические требования к безопасности средств личной гигиены" в строке "НД на методы испытания" руководствоваться Приложением 9 настоящих санитарных правил.

««.... 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50